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이 름
  김수연 2016-03-08 16:11:06, Hit : 4075
제 목   shRNA 제작 프로토콜
[방법 1]

1) Vector (pSilencer 3.1-H1 neo vector) 3ug을 BamH I과 Hind III로 Enzyme cutting한다. (Enzyme cutting 동안 2-4 진행)

2) FP/RP annealing – a나 b 중 하나를 선택하여 mixture를 만든다.

a.
FP                         2 ug
RP                         2 ug
10X Taq buffer         5 ul
D.W                        x ul
-------------------------------
                     Total 50 ul

b.
FP                         2 ug
RP                         2 ug
D.W                        x ul
-------------------------------
                     Total 50 ul

3) Incubation – 90℃, 3 min

4) Incubaion – 37℃, 1 hr

5) 4번 product의 5ul를 D.W 45ul와 섞는다.

6) Vector gel purification

7) ligation
- (Annealing한 product(5)) + (purification을 통해 얻은 vector(6))

Insert                            1 ul
pSilencer (50ug/1ul)       1 ul
10X T4 ligase buffer        1 ul
T4 ligase                       1 ul
D.W                              6 ul
--------------------------------
                    Total 10 ul


8) Transformation

9) Mini-prep 후 construct 확인



[방법 2]

1) Vector (pSilencer 3.1-H1 neo vector) 3ug을 BamH I과 Hind III로 Enzyme cutting한다. (Enzyme cutting 동안 2-4 진행)

2) FP/RP annealing

FP                         2 ul
RP                         2 ul
10X Taq buffer         5 ul
D.W                       41 ul
-------------------------------
                     Total 50 ul


3) Incubation – 95℃, 4 min

4) Incubaion – 70℃, 10 min

5) Annelaing한 mixture를 BamH I과 Hind III로 Enzyme cutting -> 생략가능

6) Enzyme cutting한 vector와 annealing한 mixture를 gel purification한다.
- Anealing한 mixture를 gel loading한 후 위에 밴드를 잘라 purification해야한다.
- 5)를 생략했다면 annealing한 mixture는 gel purification 하지않고 바로 ligation에 사용한다.

6) Ligation
(Insert size:- 60 bp, Vector size - 4285 bp)

7) Transformation

8) Mini-prep 후 construct 확인



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