제목 없음

ID:
PW:

 

    

  

   

 

 

  

     

     

     


접속된 회원 및 총회원 목록보기

현재 0분께서 회원으로 접속해 있습니다. 0
409  1/21
  View Articles
유경재 님께서 남기신 글 (2004-03-18 18:44:35, Hit : 15280)
엘피스에서 퍼온 웨스턴 방법..

제가 사용하는 방법을 올립니다. 다른 것 생각마시고 그대로 해보세요. 일단 결과를 먼저 얻은 후 원리에 대해 좋은 책자하나 찾아 공부해 보세요.
그럼 좋은 결과 있으시길..



Reagents 1x Transfer buffer
  3.03g/L Trisma-base
  14.4g/L Glycine
  20% MeOH (200 ml/L)

10x TBS (Tris-Buffered Saline)
  0.2M Tris pH 8 (24.2g Trisma base)
  1.37M NaCl (80g NaCl)
  Adjust pH7.6 by conc HCl

TBST
1x TBST
0.1% Tween 20

Blocking Solution
1-5% Nonfat milk in TBST
or 1-5% BSA in TBST



Protein Transfer

1. PVDF membrane을 gel 크기에 맞게 자른 후 100% methanol에 1-5분간 담가둔다.

  *Mini-gel 전기영동 장치를 사용하는 경우 membrane을 6x8cm로 미리 잘라 놓고 보관하는 것이 편리하다.
  *Methanol을 처리하는 것을 membrane activation이라 하며 gel내의 단백질이 membrane과 hydrophobic interaction을 할 수 있게 만들어 주는 과정이다. Nictrocellulose를 사용할 경우에는 이과정이 필요없다.

2. Methanol 처리를 한 membrane을 1x transfer buffer로 옮겨준 후 10분간 방치한다.

   * 이후 membrane에서 절대 물기를 말려서는 안 된다.

3. Trasfer할 gel을 1x transfer buffer로 살짝 적셔주고 membrane위에 기포가 생기지 않도록 주의하며 올려 놓는다.

4. Gel과 membrane을 밀착시키 후 양면에 1x transfer buffer로 미리 적셔준 3M paper 또는 두꺼운 도화지를 대고 Transfer 키트에 장착한다.

   * 3M paper는 상당히 고가로 도화지를 사용해도 무방하다.
   ** 반드시 음극과 양극을 확인.

5. Mini-gel transfer kit인 경우, 100V에서 1시간 transfer한다. 이때 발생하는 열을 막아주기 위하여 Transfer tank를 얼음속에 놓아두어야 한다.

   *Hoefer kit인 경우 ice tray를 사용하는 것이 편리하다.

6. Transfer가 끝난 후 장치를 해체하고 membrane을 분리하여 1xTBST로 살짝 앃어준다. (그전에 membrane을 물기가 없을 정도로 살짝 말려서 membrane의 후면을 TBST에 띄우면 단백질 band가 보이는데 이로써 transfer가 잘 되었는지를 확인할 수 있다, 이는 단백질이 있는 부위가 없는 부위보다 먼저 수화 (hydration)되기 때문으로 오래 관찰할 수는 없다)

7. Transfer가 제대로 되었는지 확인하기위해 transfer한 gel을 염색하거나 membrane을 Ponceau S로 염색하기도 한다.

    * 개인적으로 나는 이러한 일을 해본 적이 없다. 아무리 큰 단백질이라도 (Laminin A 400KDa) transfer가 문제가 되어 western 결과가 않나온 적은 없기 때문이다.


Antibody Reaction

1. Membrane을 blocking solution에 담그고 1시간동안 shaker위에 올려 놓고 흔들어 준다.

    *수분증발을 막기 위해 tray의 뚜껑은 반드시 닫아두어야 하며
    * Blocking reagent의 종류와 농도는 전적으로 경험에 의한 것으로서 사용하는 항체들의 affinity 와 specificity에 의해 결정된다.
    * BSA를 사용하는 경우에는 non-specificity가 많이 나타나 가급적 우리 lab에서는 BSA의 사용을 자제하고 있으며 5% Skim milk를 주로 사용하고 있다.

2. 검출하고자하는 단백질에 대한 1차항체를 판매회사의 권장 희석비율에 따라 Blocking solution에 희석하고 membrane에 1시간동안 처리한다 (10-15 ml가 적당).

   * 항체를 membrane이 있는 blocking solution에 직접 넣어서는 안 된다 (high backgroud spotting의 원인이 됨)

3. TBST로 15분씩 4회 세척한다.

    * 많은 양의 TBST도 중요하지만 가능한한 자주 (예를 들면 10분씩 6번) 세척하는 것이 backgroud를 줄이는데 도움이 된다.

4. 1차 항체를 인지하는 2차 항체를 권장 희석비율에 따라 blocking solution에 희석하고 membrane에 처리한다.

5. TBST로 15분씩 4회 세척한다.

    * 전과정에서 shaking이 원활히 되지 않을 경우엔 backgroud가 심해지거나 negative staining이 될 수 있으므로 shaking이 제대로 되고 있는 지 수시로 확인해 볼 필요가 있다. 특히 tray의 좌우측벽면에 membrane이 걸쳐 있게 되면 처음부터 실험을 다시 해야 한다.
    * 1차 항체의 affinity와 specificity가 좋다면 1차 항체에 직접 peroxidase나 alkaline phosphatase등의 효소를 직접 cross-link하여 사용하는 것도 시간적으로 생각해 볼 만하다.
    * 사용했던 blocking solution과 항체는 -20C 에 보관하며 수차례 재사용이 가능하다 (항체 가격이 워낙 비싸서!!!)
   * 처음 사용하는 항체의 적절한 titer를 잡는 일 또한 아주 중요한데 실제로 본 실험을 수행 하기에 앞서 사용하고 있는 항체의 적절한 titer를 산출하는 방법을 소개하고자 한다 (개인적으로 사용하는 방법이나 효과를 많이 보았음) 바로가기


Detection (ECL법)

ECL (enhanced chemiluminescence)는 Peroxidase의 기질인 luminol이 peroxidase에 의해 산화되면서 푸른색 빛을 내는 것을 x-ray film상에 감광시키는 방법으로 ng수준의 단백질을 검출할 수 있다. ECL용액은 구입하거나 직접 제조하여 사용할 수도 있다.

1. Solution A (Luminol과 enhancer 포함)와 Solution B (Hydrogen peroxide포함)를 동량으로 섞어준 후 1분간 잘 흔들어 준다.
     * 8x6cm membrane인 경우에 각 1ml씩이면 충분하다.

2. TBST에서 membrane을 꺼내 물기를 적당히 제거해 준 후 혼합한 ECL용액에 담그고 1분간 흔들어주면서 고루 적신다. (반응시간은 ECL의 조성과 종류에 따라 다르므로 주의)

3. Membrane을 꺼내 물기를 적당히 제거한 후 랩으로 싸서 필름카세트에 잘 붙이고 암실로 가서 현상한다.
    * 랩대신에 overhead project film을 두장을 겹쳐 사용하면 구겨지지도 않으면서 다루기 편하고
       재활용까지 가능하다
    * 필름에 노출시키는 시간은 sinal의 강도에 따라 달라지며 membrane위에서 파란 빛이 눈으로
       확인될 정도라면 10-20초가 적당하다. (자세히 보면 대부분의 band가 보인다)
    * 오랜 시간을 노출시켜도 signal을 볼 수 없으면 좀 더 효과적인 ECL제품을 구입해서 사용한다.

          "좋은 Signal과 낮은 Backgroud는 전적으로 실험자의 몫이다"




Prev
   SUMOlyated proteins? [1]

유경재
Next
   김명선 축하해! [1]

백광현
Copyright 1999-2022 Zeroboard / skin by Go!JiNny